GENETIQUE

1) Comment se transmet la maladie ?

Pour comprendre le mode de transmission du syndrome de Marfan, il faut se rappeler que les quelque 30 000 gènes humains sont répartis sur 23 paires de chromosomes, dont 22 sont communes à tous (les autosomes) et une détermine le sexe (les hétérosomes : X et Y). On parle de “ paires ” car chacun de nous possède en fait deux jeux de 23 chromosomes, dont l’un provient de sa mère et l’autre de son père.

Le syndrome de Marfan, se transmet selon un mode appelé autosomique dominant . Le gène responsable est en effet porté par un chromosome non sexuel, ou “ autosome , “ Dominant ” signifie qu’un individu est atteint du syndrome -c’est-à-dire qu’il montre des signes cliniques de la maladie - dès lors qu’une seule des deux versions du gène qu’il possède porte une mutation délétère.

Cela signifie que le risque pour un sujet atteint de transmettre la maladie à ses enfants est de 50% quelque soit leur sexe et que ce risque est indépendant pour chaque enfant

En effet, au moment de leur formation dans les ovaires ou les testicules, les cellules sexuelles (ou gamètes) ne reçoivent qu’un chromosome de chaque paire, pris au hasard. Chaque gamète d’un individu Marfan a donc une chance sur deux de posséder la version mutée du gène.

Par ailleurs, le syndrome ne saute pas une génération : tous les individus porteurs du gène muté sont affectés, et les enfants non affectés de parent(s) Marfan ne sont pas porteurs..

Il arrive cependant qu’un enfant soit atteint du syndrome de Marfan alors que ses parents sont indemnes. Dans ce cas, une mutation s’est produite spontanément dans l’ovule, le spermatozoïde ou après la fécondation pendant le développement embryonnaire; il s'agit d'une forme sporadique. Pour le sujet atteint le risque de transmettre la maladie a la descendance est le même que dans les formes familiales.

2) La découverte du gène « Marfan »

Très schématiquement, les gènes sont de toutes petites portions de l’immense molécule d’ADN qui constitue chaque chromosome.
Chacun porte l’information suffisante pour que la cellule dans laquelle il s’exprime synthétise une – parfois plusieurs – protéine qui remplira une fonction biologique. On dit qu’un gène « code » cette protéine.
L’information est contenue dans l’ordre de succession (la « séquence ») des quatre types de maillons de base de la chaîne de l’ADN, que l’on peut assimiler à des lettres.
Une mutation est le remplacement, la perte ou l’ajout d’une– ou de plusieurs – lettre. Lorsqu’elle se produit dans un gène, cela altère l’information dont il est porteur.
La cellule peut alors produire une protéine modifiée qui ne remplit pas correctement, voire pas du tout, sa fonction biologique. Il arrive aussi que la mutation empêche tout simplement la synthèse de la protéine

En 1991 des biologistes ont identifié ont apporté la preuve que la maladie de Marfan est due à une mutation du gènede la fibrilline 1, situé sur le chromosome 15 .


Découvert en 1991 sur le chromosome 15, le gène FBN1 code une protéine appelée fibrilline 1, le principal composant des microfibrilles. Ces structures elles-mêmes s’assemblent en fibres élastiques ou non caractéristiques du tissu conjonctif. Le syndrome de Marfan est dû à des mutations ponctuelles du gène FBN1 qui, selon les cas, entraînent la synthèse d’une fibrilline 1 anormale ou empêchent toute synthèse



Ce gène FBN1 est particulièrement long la fibrilline 1 est une protéine de très grande taille, aussi beaucoup de mutations différentes peuvent s’y produire.
Au sein d’une même famille, c’est évidemment la même mutation qui se transmet, mais pour l’instant, chaque famille étudiée – et chaque cas spontané semble avoir « sa » propre mutation. On en a déjà recensé plus de 1000… Cette multiplicité empêche la mise au point d’un test génétique universel de la maladie de Marfan .
En 1994, une grande famille française atteinte de la maladie de Marfan, a été étuddiée A l’hopital Ambroise Paré et les sujets atteints ne présentaient pas de mutation dans le gène FBN1. Un autre gène était donc à découvrir ;il a été identifié en 2003, il s’agit du gène TGFBR2 (sur le chromosome 3).

De puis plusieurs familles ont présenté une anomalie dans ce gène.

3) MFS et laboratoire

Différents types de prélèvements

Trois types de prélèvements peuvent être réalisés dans un contexte de diagnostic :

un prélèvement sanguin
une biopsie cutanée
une pièce anatomique.

Le prélèvement sanguin a pour objectif d’obtenir de l’ADN pour faire une recherche de mutation.

La biopsie cutanée est mise en culture pour obtenir des fibroblastes, cellules qui synthétisent les différentes protéines de la matrice extracellulaire.
A partir de la culture de fibroblastes, différentes études pourront être entreprises :

étude de la production de fibrilline.1 par les fibroblastes extraction d’ADN pour faire une recherche de mutation extraction d’ARN pour étudier l’effet de la mutation.

Le 3ème prélèvement est la pièce anatomique, prélevée au cours d’une intervention chirurgicale. Le plus souvent il s’agit d’un fragment d’aorte récupéré lors d’un acte chirurgical pratiqué pour prévenir ou traiter une dissection de l’aorte. Ce fragment est utilisable pour différents traitements et types d’examens :

un examen histologique classique pour évaluer la qualité de l’aorte (étude au microscope après coupe et coloration)
congélation immédiate et étude ultérieure de structures et de composants particuliers du tissu
traitement immédiat pour mise en culture des cellules musculaires lisses de la paroi de l’aorte. Ces cellules assurent la synthèse des composants de la matrice extracellulaire.

Contexte réglementaire

Parmi tous ces examens, certains sont utilisés pour le diagnostic, d’autres uniquement dans le cadre d’activités de recherche. Les prélèvements pour réaliser ces examens sont soumis à des réglementations différentes.
Quel que soit le type de prélèvement, s’il a pour objectif une analyse d’ ADN, il ne pourra être prescrit qu’au cours d’une consultation et que par un médecin généticien ou par un médecin d’une autre spécialité mais appartenant à une consultation multidisciplinaire déclarée auprès des autorités sanitaires régionales et nationales. Le médecin devra informer son patient du type de prélèvement, du ou des examens qui seront réalisés et dans quel but. Une fois cette information donnée, un formulaire de consentement doit être signé et fourni au laboratoire avec le prélèvement. Le patient conservera une copie de ce formulaire de consentement. Dans quelques cas, le médecin pourra être amené à proposer un formulaire d’un autre type appelé formulaire de non opposition. Ce type de formulaire permet de recueillir le consentement pour la réalisation d’examens divers qui pourraient éventuellement être réalisés, mais dont la nature précise n’est pas déterminée au moment où le prélèvement est réalisé. En pratique, ce type de consentement “ a priori ” est recherché pour des pièces anatomiques voire des biopsies. Pour les prélèvements réalisés dans le contexte d’un protocole de recherche, les formalités sont comparables : information du patient par l’un des médecins participant au protocole de recherche, signature d’un consentement.
Le résultat d’un examen à visée diagnostique ne sera rendu qu’au médecin prescripteur qui est chargé de le rendre au patient au cours d’une nouvelle consultation. Par contre, s’il s’agit d’un prélèvement utilisé pour la recherche, il n’y aura pas lieu de rendre un résultat.

Transfert des prélèvements au laboratoire exécutant

Le transfert du prélèvement devra être réalisé dans un temps plus ou moins court, qui dépend du type d’examen réalisé. En pratique courante, pour une analyse d’ADN, le prélèvement sanguin devra être transmis dans les 24 à 48 heures suivant la prise de sang. Le transport sera réalisé à température ambiante, par transporteur soit interne (navette entre hôpitaux publiques d’une même ville) soit externe (services postaux, transporteurs privés…). Pour les autres prélèvements, ceux-ci devront parvenir dans les plus brefs délais dans le service qui va les étudier.

Prise en charge

La nomenclature des actes de génétique moléculaire n’est précise que pour un nombre limité de maladies héréditaires. Pour toutes les autres maladies, il existe un tarif forfaitaire de base codifié à B 500 (soit 500 x 0,27 euros = 135 euros). Les actes sont totalement remboursés et donc sont accessibles à tous les assurés. Par contre, ce tarif forfaitaire est très en-dessous du coût réel d’une étude moléculaire lorsqu’il faut explorer de très grands gènes et/ou plusieurs gènes. De ce fait, les laboratoires référents reçoivent des crédits ministériels spécifiques ( crédits D.H.O.S. pour Direction de l’Hospitalisation et de l’Organisation des Soins) permettant de couvrir la différence de coût.

Quels laboratoires ?

L’étude de gènes dans un contexte de diagnostic est réservée à des laboratoires et des biologistes qui sont agréés par les autorités sanitaires. L’objectif de cet agrément est d’encadrer ces activités nouvelles et coûteuses, de s’assurer de la compétence des biologistes réalisant les actes et, par la visite du laboratoire, s’assurer que les conditions réglementaires (locaux, matériel, personnel, procédures de qualité…) sont remplies et donc garantissent la qualité des examens réalisés.
Une fois l’agrément obtenu, il couvre l’étude de tous les gènes. La majorité des centres et biologistes agréés sont publiques, hospitaliers. En pratique, la plupart des laboratoires n’analysent qu’un nombre limité de gènes. Le choix des gènes étudiés est le reflet de plusieurs éléments :

- le rapport coût / bénéfice pour la prise en charge du malade,
- les compétences propres développées par les biologistes dans un groupe de pathologies,
- les besoins locaux ou régionaux.

Ainsi l’étude du gène FBN1 a d’abord été uniquement réalisé en France à l’hôpital Ambroise Paré par transfert des activités diagnostiques qui avaient été développées dans notre laboratoire de recherche INSERM. Depuis 2005, l’étude est aussi réalisée par le Dr. Khau Van Kien dans le laboratoire du Pr. M. Claustres à Montpellier.

Etapes du diagnostic par génétique moléculaire

L’étude d’un prélèvement comprend plusieurs étapes. Il faut d’abord extraire l’ADN des globules blancs, puis vérifier sa qualité et la quantité obtenue.
A l’issue de cette première étape, si des conditions de qualité et de quantité ne sont pas remplies, un nouveau prélèvement est demandé.
Une fois l’ADN obtenu, les 65 exons (ou régions de l’ADN contenant l’information nécessaire à la production de la protéine fibrilline-1) du gène FBN1 sont analysés, base à base à la recherche d’une mutation (c’est-à-dire une anomalie capable d’altérer la production de la fibrilline-1). Cette recherche est techniquement longue, comportant un certain taux d’échec et encore relativement peu automatisée. Elle nécessite donc un temps important de technicien pour étudier chaque prélèvement. Une fois une altération trouvée, le biologiste intervient. Son rôle est d’évaluer s’il s’agit bien de la mutation associée à la maladie ou bien d’une variation sans grande conséquence sur la fonction de la protéine.
De façon schématique, on observe deux grands types d’altération selon leur effet sur la production de la protéine :
- soit on observe une mutation non-sens ou codon Stop prématuré conduisant à l’apparition anormalement précoce d’un signal de fin de synthèse de la nouvelle protéine synthétisée. Cette situation est la plus simple car elle ne nécessite pas d’examen supplémentaire puisque l’altération est par son essence même une mutation.
- soit on observe une variation faux-sens conduisant au remplacement d’un seul acide aminé par un autre dans la protéine. Ce cas est plus complexe car il va falloir alors trancher entre une mutation responsable de la maladie ou une simple variation sans effet pathologique. La deuxième situation est la plus délicate et nécessite d’approfondir les conséquences hypothétiques ou réelles de l’altération sur la production de protéine par les cellules qui en sont porteuses. Donc, pour conclure dans un sens ou dans l’autre, il faudra accumuler les arguments supplémentaires : tester l’effet de la mutation in vitro sur la production de la protéine (test relevant plus d’un laboratoire de recherche que d’un laboratoire de diagnostic) ou de l’ARNm (intermédiaire de transmission de l’information contenue dans l’ADN vers la synthèse d’une protéine), absence de cette variation chez au moins 100 sujets témoins, propriétés physico-chimiques du nouvel acide aminé susceptibles d’altérer la fonction de la protéine, présen ce de la variation chez les apparentés (dans le cas d’une mutation, tous les sujets malades sont porteurs de la variation alors que les apparentés non malades n’en sont pas porteurs)…,
L’une des meilleures informations que puisse apporter la génétique moléculaire dans le syndrome de Marfan est le caractère sporadique de la mutation. Il s’agit de constater que les parents biologiques du patient ne portent pas cette mutation, montrant ainsi qu’il s’est produit une mutation dans un des gamètes (spermatozoïde ou ovocyte) dont le patient est issu. ce type d’évènement est fréquent dans le gène FBN1. il permet de comprendre pourquoi plus de 25 % des malades n’ont aucun apparenté malade. Pour les parents d'un enfant atteint d'une forme sporadique de syndrome de Marfan le risque d'avoir un deuxième enfant atteint de ce syndrome est très faible et devra être évalué lors d'une consultation de génétique.

Quel est l’intérêt de rechercher une mutation ?

En dehors d’un contexte de recherche, l’identification d’une mutation n’est reconnue comme utile au diagnostic que dans des situations particulières. Il est important de re-souligner que le diagnostic de Marfan reste essentiellement une démarche clinique. Par ailleurs, une fois le diagnostic posé chez un sujet, la caractérisation de la mutation n’a pas d’intérêt pour la prise en charge, le suivi et ne fournit aucun élément prédictif quant à l’évolution et la gravité de la maladie. Par contre, la recherche d’une mutation aura toute son importance dans deux cas :
-Pour un premier diagnostic de syndrome de Marfan dans une famille : lorsque le diagnostic clinique reste incertain après un examen multidisciplinaire, la mise en évidence d’une mutation permettra d’affirmer le diagnostic. Mais attention : même si aucune mutation n’est retrouvée, le diagnostic de “ Marfan ” ne pourra être éliminé. En effet, l’analyse moléculaire ne peut explorer qu’une partie du gène.
- Pour le diagnostic chez des apparentés d’un sujet chez lequel le diagnostic clinique a été établi. Il s’agit alors de confirmer ou d’infirmer le diagnostic chez des sujets ayant peu ou pas de symptomes (dont les enfants puisque la maladie peut n’apparaître qu’au cours de l’adolescence).
Il ressort donc que, en pratique, la recherche de mutation sera réalisée dans des circonstances variables et sera toujours précédée d’un dialogue entre clinicien et biologiste pour en évaluer l’intérêt diagnostique.

et il faudra combien de temps pour avoir le résultat?

Il n’y a pas de réponse simple à cette question. La plage de temps est variable allant de 15 jours à plusieurs années avec des “ moyennes cibles ” de 18 mois pour une première recherche de mutation dans une famille et de 1 à 2 mois pour une recherche de mutation déjà connue chez un sujet apparenté.

Comment expliquer une telle variation ? En prenant en compte les éléments suivants : le temps minimal nécessaire pour réaliser les différentes étapes actuelles du diagnostic génétique exposées plus haut, le nombre de techniciens réalisant ces étapes, le nombre de biologistes analysant les résultats, le nombre de secrétaires gérant le travail et rédigeant les compte-rendus, le nombre de demandes reçues par un laboratoire. Pour un diagnostic en urgence réalisé par un technicien et analysé par un biologiste, il faut au minimum 15 jours. Ceci représente une situation idéale qui en pratique ne sera mise en oeuvre que lorsqu’un diagnostic devra être réalisé en extrême urgence (cas très rare dans des circonstances particulières dont le diagnostic prénatal qui ne sera pas abordé dans cet article). En pratique courante, les demandes reçues par les deux laboratoires sont supérieures voire largement supérieures aux capacités de réponse des laboratoires. Les biologistes gèrent donc en permanence un équilibre fragile pour répondre au mieux des demandes avec les moyens dont ils disposent. Des évolutions techniques ont déjà permis d’améliorer le diagnostic moléculaire tant du Marfan que de toutes les autres maladies héréditaires puisqu’il y a à 10 ans, le laboratoire d’Ambroise Paré avait étudié en une année tout le gène FBN1 chez 15 sujets (utilisation de techniques manuelles par un technicien) alors qu'en 2006, 4 techniciens ont étudié tout le gène FBN1 chez 120 sujets, tout le gène TGFBR2 chez 240 sujets et ont réalisé la recherche d’une mutation connue chez plus de 300 apparentés. Seule l’évolution des techniques et leur automatisation permettront d’augmenter encore le nombre de sujets analysés par an et de diminuer de façon encore plus marquante le délai de rendu des résultats.